Nach der Zeit als Apothekerpraktikant 1952-1954 in Giengen/Brenz studierte Ernst Mutschler Pharmazie in München und Tübingen. Danach wechselte er nach Mainz, um dort unter der Leitung von Professor Dr. Hans Rochelmeyer über Pilzinhaltsstoffe zu promovieren. An die Promotion 1959 zum Dr. rer. nat schloss sich die Habilitationsarbeit in Pharmazeutischer Chemie an. 1964 erfolgte die Venia legendi für das Fach Pharmazie.
Noch während der Assistentenzeit begann Ernst Mutschler ein Medizinstudium, legte 1965 die Ärztliche Prüfung ab und wurde 1966 mit Professor Dr. Gustav Kuschinsky als Doktorvater zum Dr. med. promoviert. 1974 erhielt er die Approbation als Arzt.
Nach Ablehnung eines Rufs auf eine H3-Professur nach Erlangen wurde er 1968 zum Abteilungsvorsteher und Professor in Mainz ernannt. 1973 bekam er einen Ruf auf ein Ordinariat für Pharmazeutische Chemie an der Universität Amsterdam, den er aus familiären Gründen nicht annahm, und kurze Zeit danach einen Ruf auf den neugegründeten Lehrstuhl Pharmakologie für Naturwissenschaftler an der Goethe-Universität Frankfurt am Main, den er bis 1997 innehatte.
Schwerpunkte seiner Forschung wurden cholinerge Agonisten und Antagonisten, Muscarinrezeptor-Subtypen, Diuretika sowie Pharmakokinetik bei eingeschränkter Organfunktion und im Alter.
Diese Untersuchungen fanden ihren Niederschlag in über 600 wissenschaftlichen Publikationen, zahlreichen Forschungspreisen (u. a. Carl-Mannich- und Host-Madsen-Medaille, Lifetime achievement in the Pharmaceutical Sciences Award, Schmiedeberg-Plakette, Dr. Willmar-Schwabe-Preis, Homburg-Preis, Preis der Deutschen Therapiewoche, Boehringer Ingelheim International Research Award, Rottendorf Pharmakologie-Preis, Phoenix-Pharmazie-Wissenschaftspreis), zwei Ehrendoktorate der Universität Regensburg und der Humboldt-Universität Berlin sowie über 150 Promotionen.
Allgemeine Bekanntheit erlangte Prof. Mutschler durch seine grundlegenden Lehrbücher wie beispielsweise das als "der Mutschler" bekannte Buch "Arzneimittelwirkungen. Lehrbuch der Pharmakologie und Toxikologie". Es gilt als Standardwerk in der Pharmakologie.